▒   전립선염의 최신진단방법 소개 - 유전자(DNA)검사를  통한 진단(PCR-S)

      유전자(gene)는 유전정보의 단위를 가리키며 DNA로 구성되어있다. 세포의 모든 생명현상과 기능은 단백질에 의해 이루어진다. 유전자는 단백질을 만들기 위한 명령체계를 지시 전달하는 광대한 정보단위이다. 하나의 유전자는 하나 혹은 다수의 특정 단백질을 만드는데 필요한 특수한 암호코드를 가지고 있다. 한 생물체가 가지고 있는 모든 유전자의 총체를 게놈(genome)이라고 한다.

      DNA의 모양은 이중 나선구조를 이루고 있고, 각각의 나선가닥에는 염기(base)라고 불리는 수많은 화학구조단위로 구성되어 있다. DNA의 염기에는 아데닌(A), 사이토신(C), 구아닌(G), 타이민(T)의 4가지 종류가 있는데, 이 염기의 배열된 순서, 혹은 염기서열(base sequence)이 곧 그 유전정보를 결정한다. 알파벳이 어떤 순서로 나열되는 가에 따라 단어와 문장이 달라지듯이 염기서열이 어떻게 배열되는가에 따라 그것이 지시하는 단백질과 유전정보가 달라지는 것이다. 최근 인간 게놈 전체의 염기서열을 판독하는 인간게놈프로젝트가 완성되어 유전자를 이용한 난치성 질환의 진단과 치료에 획기적인 발전이 이루어지고 있으며, 소위 맞춤의학, 예측의학의 시대가 열리고 있다.

  DNA의 유전정보는 일차 mRNA로 바뀌며, 이를 전사(transcription)이라 한다. RNA의 유전정보는 리보솜에서 단백질로 해석(translation)된다. 3개의 염기가 하나의 아미노산을 지정하며, 이러한 3개 염기의 단위를 코든(codon)이라고 한다. 전사과정에서 DNA중 단백을 지정하는 부분만 RNA로 되고, 나머지 부분은 잘려나간다. 세포가 분열될 때 DNA는 똑 같이 복제(replication)되어 자손 세포에 전달된다. 

유전자가 주어진 역할과 기능을 적절히 수행할 때, 인체는 정상적으로 발생하고 기능을 발휘하며, 생명을 유지해 갈 수 있다. 그러나 유전자의 아주 작은 부분이라도 변화되거나 결실되면서 이상이 생기면 그로 인해 각종 질환과 기형, 심한 경우 사망을 초래할 수 있다. 유전학의 발전에 따라 각 유전자의 기능이 무엇이며, 각 유전자가 질병과 어떠한 연관성을 가지고 있는지가 밝혀지고 있으며, 특정 질환과 관련된 유전자 변이도 확인이 가능하게 되었다.

3. 유전자검사

  유전자검사는 특정 질환의 원인이 되는 이상 유전자나 혹은 원인 세균의 유전자를 검사하므로서 질병을 진단하고 예측하는 새로운 형태의 진단법이다.

  유전자 진단법은 기존의 임상 진단법과는 다른 점이 많다. 기존의 진단법은 질병의 증상이나 증후 등 나타난 현상을 보고 진단하는 데 대해, 유전자검사는 질병의 근원이 되는 유전자이상을 파악하므로서 진단한다. 따라서 질병이 나타나기 전에 미리 진단하고 발병 여부를 예측하는 것이 가능하고, 보통의 검사로 진단되지 않을 때에도 소량의 검체만으로 정확하게 진단할 수 있다. 

가장 많이 알려진 유전자검사는 신생아선별검사이다. 그러나 유전자검사는 감염과 암을 포함한 후천성 질환의 진단에도 유용하며, 친자감식 등에도 가장 정확한 검사이다.

  유전자검사의 방법으로 과거에는 세포유전학적 방법(cytogenetic study)이 사용되었다. 이는 세포에서 염색체의 수적인 변화나 구조적 이상을 보는 것으로 그 민감도에 한계가 있어서 특별한 경우를 제외하고는 잘 사용되지 않는다.

  오늘날에는 분자생물학적 유전자검사가 주로 사용된다. 이는 체액과 세포, 조직 등에서 분리한 DNA 및 RNA를 가지고 어떤 질환과 관련된 특정유전자를 검사하는 방법이다. 혈액이나   침, 전립선분비액 한방울 등 극소량의 검체로도 검사가 가능하다. 소변과 대변, 죽은 세포, 심지어 주라기공원이란 영화에서 보듯 수억년된 화석에서도 검사가 가능하다. 물론 파라핀에 포매되어 수년이상 보관된 조직에서도 DNA와 RNA의  분석이 가능하다. 

  여기에서 분자생물학적 유전자검사에 사용되는 몇 가지 대표적 방법을 review 하실 필요가 있다.

  먼저 PCR로, 이는 검체 내에 존재하는 특정 DNA조각을 선택적으로 증폭시키는 것이다. 예컨대 전립선염 환자의 소변이나 전립선액(EPS)에는 원인균이 존재하나 그 수가 너무 작을 때, 혹은 파괴되어 있을 경우 통상의 방법으로는 확인이 불가능하다. 이런 경우 검체 내에 존재하는 세균의 유전자만을 수천만 배로 증폭하여 검사하며, 이러한 유전자 증폭의 기술이 곧 PCR이다.

  다음은 블라팅(blotting) 혹은 보합반응(hybridization)이다. 이는 DNA의 A와 T 염기, C와 G 염기가 각각 서로 짝을 이루어 결합하는 성질을 이용한 것으로, 표적 유전자에 상응하는 탐식자(probe)를 가지고 검체 DNA와 반응시켜서 확인하는 방법이다. 예컨대 표적유전자의 염기서열이 ACGT인 경우 이에 상응하는 TGCA의 탐식자를 준비하고, 여기에 방사선동위원소나 형광 등의 표지물질을 붙여서 반응시킨다. 이후 방사선이나 형광이 나타나는 것을 조사하면 검체 내에 특정 유전자가 존재하는지 여부와 그 양을 확인할 수 있다.

자동염기서열분석법(automated sequencing)이 있다. 이는 검체 DNA의 염기서열을 해독하므로서 특정 유전자의 변이(variation) 여부를 검사하는 것이다. 혹은 검체 내 세균의 정체와 계통(phylogenic tree)을 파악할 수도 있다. 자동염기서열분석법은 그러나 시간과 비용이 많이 소요되며, 한번에 소수의 검체만 판독이 가능하다는 단점이 있다.  

  최근에는 DNA칩이 각광을 받고 있으며, 이것이 기존의 검사인 블라팅이나 염기서열분석법을 대치해 나가는 추세이다. 반도체 칩이 컴퓨터의 정보를 읽는 칩이라면, DNA 칩은 유전정보를 읽는 고밀도의 바이오칩이다. DNA칩은 고속의 로보트 기술과 컴퓨터를 이용하여 다수의 유전자 조각을 유리글래스 위에 붙인 것이다. DNA 칩에 형광을 붙인 검체 DNA를 가한 후 블라팅이나 염기서열반응이  일어나게 한 후 특수 형광분석기(스캐너, scanner)로 판독한다. 이로서 한꺼번에 다수의 유전자의 변화를 검사할 수 있다. 특히 다수의 유전자를 정확하고 신속하게 검사해야 할 때 적합한 진단도구로 기대되고 있다.

4. 전립선염의 유전자검사

    최근 기존의 방법으로 진단이 애매한 전립선염 환자에서 진단을 위해 유전자검사법이 각광을 받고 있다. 구미에서는 Washington대 비뇨기과를 중심으로 5년전부터 PCR등의 방법을  전립선염 및 요도염의 진단에 이용하려는 시도가 이루어 져 왔으며, 이는 점차 일반화되고 있다. 최근에는 국내에서도 C대 및 J대 등 일부 대학병원을 중심으로 PCR이 전립선염의 진단을 위한 비급여 검사로 적용되고 있다. 그러나 PCR만으로는 전립선염을 진단하는 데에는 한계가 있으며, 정확한 진단을 위해서는 전문적인 유전자검사 시설과 연구진이 필요하다.

      전립선염의 진단을 위한 PCR검사에 대한 문헌보고를 보면 다음과 같다.

      Krieger등이(1996) 원인불명의 난치성 만성전립선염 환자 135례에서 전립선조직을 얻어 16s ribosomal RNA유전자의 DNA(16s rDNA)와 Chlamydiae trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplamsa hominis, Trichomonas vaginalis에 대한 PCR검색을 한 결과 그 중 77%에서 16s rDNA가 양성이었으며, 약10%에서 검색 균주가 확인되었다고 보고한 바 있다. 여기에서 16s ribosomal RNA는 모든 세균에서 공통적으로 나타나는 유전자의 부위이다. 이러한 결과는 특발성 만성전립선염의 대다수가 실제로는 세균감염에 의해 나타남을 시사한다. 이후 이와 유사한 보고가 수없이 나오고 있다.

      Krieger등은(1998, 2000) 연속된 연구에서 16s rDNA의 염기를 분석하므로서 전립선염의 원인균을 조사하였으며, 그 결과 약 절반은 기존에 알려진 그람음성 요로세균이었으나, 나머지 절반은 Aseromonas 등 기존에 잘 알려져 있지 않은 세균들로 밝혀졌다고 보고하였다. 이러한 보고는 전립선염에서 기존의 배양검사로 왜 균주가 검출되지 않는지의 이유를 설명해 준다. 

Hochreiter와 Schaefferemdd은(2000) 장기제공 정상인군과 전립선비대증 및 전립선암군을 대상으로 각각 16s rDNA의 PCR을 시행하였으며, 그 결과 전립선조직내 염증이 있었던 경우에는 모두 양성이었으나, 염증이 없었던 경우에는 모두 음성으로 나타났다고 보고한 바 있다. 이러한 결과는 첫째, 16s rDNA의 PCR이 전립선염증의 진단에 있어 매우 뛰어난 검사이며, 둘째,  전립선염의 대다수는 실제 세균감염에 의해 발생함을 시사하며, 이는 곧 전립선염에서 PCR검사가 큰 가치를 가짐을 가리킨다. 

5. 전립선염진단 유전자검사: 목적

      전립선염에 대한 유전자진단 시스템의 목적은

    첫째, 전립선염 및 요도염을 정확하게 진단하며,

    둘째, 세균감염의 유무를 확인하고,

    셋째, 원인균주를 파악하며,

넷째, 항균제 내성 여부를 파악하며,

다섯째, 치료 후 세균감염의 치유 여부를 확인하고,

여섯째, 재발시 이를 조기에 파악하려는 데 있다.

여기에서 원인균주 확인에는 기왕에 밝혀진 세균, 즉 대장균 등 그람음성세균 뿐 아니라 Staphylococci등 그람양성세균과 Chlamydia, Ureaplasma, Mycoplasma, Trichomonas 등의 세균은 물론이며, 기왕에 잘 밝혀져 있지 않은 세균까지 밝힌다. 

6. 전립선염진단 유전자검사: 방법과 결과 보고

1) 검체

    기본적으로 검사하는 1차 검체는 전립선마사지로 얻은 전립선액(EPS)와 전립선마사지전 첫줄기 소변(VB1) 혹은 요도세척액이다. 여기에서 요도세척액은 10ml주사기에 주사용증류수를 넣고 주사기의 끝을 요도구에 삽입, 증류수 4-5ml을 주입한 후 나오는 액체를 받으면 된다. 만약 EPS의 검체가 어려울 때는 대신 전립선마사지후 소변(VB3)으로 대신한다. 혹은 EPS대신이나 추가로 정액을 검사할 수도 있다. 검체를 받을 때는 포피를 벗기고 귀두와 요도구를 알코올 스폰지등으로 닦아서 소독한 후 받도록 한다.

    검체는 보통 검사기관에서 제공하는 DNA card의 표시된 부위(circle)에 받는 것이 좋다. 즉 EPS를 card에 직접 묻히거나 소변, 요도세척액을 card에 떨어뜨리면 된다. DNA card를 다룰 때는 오염의 위험을 피해 소독된 장갑을 끼고 다루어야 한다. DNA card는 그냥 대기상태로 두어 말린 후, 소독된 plastic bag에 넣은 후 편지봉투에 넣어서 등기속달이나 택배 등으로 검사기관에 보내면 된다. 혹은 연락을 주어 검사기관이 수거하도록 한다. DNA card내에 도포된 검체는 수주이상 안전하게 보관된다.

  2) DNA분리 및 정제

  보내진 DNA card의 일부를 잘라서 여기에서 DNA를 분리하여 PCR을 하게 된다.

3) 1단계 검사(Pis-01)

  가장 기본적인 검사는 모든 세균의 게놈내에 존재하는 16s rRNA의 유전자를 PCR로 증폭한 후 이의 존재 유무와 그 양을 블라팅(blotting)으로 확인하는 것이다. 대조군 실험결과를 볼 때 검체내에 단 하나의 세균이 있어도 양성으로 나타날 정도로 민감도가 높다. 여기에 본사에서는 오염을 차단하므로서 가음성은 나타나지 않도록 유의하고 있다.

  검사결과 만약 EPS나 VB3, 혹은 정액에서만 16s rDNA가 양성으로 나오고 VB1은 음성이라면 전립선염으로 진단할 수 있다. 만약 EPS나 VB3뿐 아니라 VB1에서도 양성으로 나올 경우 전립선염과 요도염의 감별이 필요하다. 이 경우 16s rDNA의 band의 강도를 비교하여 EPS나 VB3의 강도가 VB1의 그것에 비해 10배이상 강하게 양성으로 나올 경우 전립선염으로 진단할 수 있다. 아울러 다음의 4)의 2단계 검사에서 중요 요로세균의 감염을 조사한다. 만약 대장균(E coli)계통으로 나오면 전립선염으로 진단할 수 있으며, 이에 대해 Chlamydiae나 Ureaplasma , Mycoplasma, Trichomonas 등이 양성이면 요도염의 가능성이 높다.

4) 2단계 검사(Pis-01)

    이것은 앞에서 기술한 것처럼 중요세균의 존재 여부를 PCR 및 블라팅으로 확인하는 것이다. 

    첫째는 대장균등 그람음성균이며, 특히 요로감염형 대장균에 공통적으로 나타나는 유전자(Usp)의 존재 유무를 검사한다.

    아울러 비임균성 요도염의 주원인균인 Chlamydiae trachomatis와 Ureaplasma realyticum, 비뇨기감염형 Mycoplasma, 그리고 Trichomonas vaginalis의 존재 유무를 검사한다. 

5) 3단계 검사(Pis-02)

    이것은 PCR로 발견된 전립선염의 원인균을 확인하는 검사이다.

    첫째는 대장균등 그람음성균이며, 특히 요로감염형 대장균에 공통적으로 나타나는 유전자(Usp)의 존재 유무를 검사한다.

아울러 비임균성 요도염의 주원인균인 Chlamydiae trachomatis와 Ureaplasma realyticum, 비뇨기감염형 Mycoplasma, 그리고 Trichomonas vaginalis의 존재 유무를 검사한다. 아울러 앞에 기술한 중요 세균 뿐 아니라 알려지지 않은 세균까지 모든 세균을 밝혀내는 것이다.

      방법은 앞의 2)에서 PCR로 증폭시켜 얻은 16s rDNA를 plasmid vector에 삽입하여 크로닝한 후에 자동염기분석법(Pis-02)과  올리고칩 및 4-color scanner로(Pis-03) 그 염기서열을 분석하는 것이다. 이후 그 염기서열이 GENEBANK의 어느 균주와 일치하는 지를 파악하므로서 원인 균주를 확인한다. 드물게 지금까지 밝혀진 바 없는 균주가 나올 수도 있으며, 이 경우 어느 계통의 균주인지를 보고하게 된다.

6)  기타 검사

      상기한 검사 외에 추가로 항균제내성 여부를 유전자검사로 확인할 수 있다. 대표적인 것은 tetracycline resistance유전자와 quinolone resistance 유전자이며, 원인균주가 이 내성 유전자를 가지고 있는지를 PCR 후 블라팅 및 올리고칩으로 확인한다(Pis-03). 물론 내성유전자 양성일 때는 해당 항균제의 투여는 피하는 것이 좋다.

상기한 검사 중 원하시는 검사를 선택하면 된다. 결과 보고에 5일에서 2주, 평균 약 1주정도 소요된다. 검사의 결과는 1) 결과의 요약, 2) 해석, 3) 개개 검사의 증빙자료의 3편으로 보고된다.

7 전립선염진단 유전자검사: 기대 효과

  전립선염에 대한 멀티플렉스 유전자진단 시스템은 기존의 임상적 검사에 민감도와 정확도가 월등하게 더 높으며, 임상에서의 활용도도 훨씬 더 커서 다양하게 이용될 수 있다. 즉

    첫째, 진단이 애매한 하부요로염증의 남성에서 전립선염과 요도염을 정확하게 감별할 수 있으며, 

    둘째, 전립선 및 요도에 세균감염이 존재하는 지를 정확하게 진단할 수 있으며, 셋째, 이는 곧 항균제 투여 적응의 기준이 될 수 있다. 또한

    넷째, 세균감염시 그 원인균주를 파악하는데 가장 정확한 검사이며, 이는 치료 필요성의 파악을 위해 필수적이다. 

다섯째, 항균제 내성 여부를 파악하므로서 항균제를 선택하는 데에도 큰 도움이 된다.

여섯째, 치료 후 세균감염의 치유 여부를 확인하는 데 유용하며,

    일곱번째, 재발시 이를 조기에 파악하는 데에도 매우 유용하다.

8.   참고자료 : PCR & 씨퀀싱 검사법을 통한 세균성 전립선염 및 성병 원인 균 검사 결과 2004년도 통계 자료 (전반기)

  총 검사 의뢰자 중 음성(정상)/양성(감염) 결과

총 검사 의뢰자	5000 case
양성 결과 (감염)	63%
음성 결과 (정상)	37%

양성(감염) 결과 (63%) 중 성별 비교

성별	양성결과 중 성별 비중
남성	88%
여성	12%

 

 세균성  전립선염 및 성병 균 검사의뢰자 중 원인 균 분포 (남녀구분없음)

  : 클라미디아에 의한  성감염이 가장 높으며, 복합 감염 또한 16%로 나타났음.

        양성(감염) 결과 중  원인 균 비중

- 자료제공 (주)굿젠 유전자검사센터(www.goodgene.co.kr)

1) Schaeffer A, Nickel JC. Diagnosis and management of prostatitis. AUA Instructional Course. May 4 1999.

2) Nickel JC, Nyberg LM, Hennenfent M. Research guidelines for chronic prostatitis consensus report from the first national institute of health international prostatitis collaborative network. Urology 1999 54:229-33.

3) Nickel JC. Prostatitis: myths and realities. Urology 1998 51:362-6.

자료출처: 굿젠 유전자검사센터(www.goodgene.co.kr)

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